Grisovin fp 105

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soppressione cinetica dei microtubuli instabilità dinamica da griseofulvina: implicazioni per il suo possibile uso nel trattamento del cancro Abstract L'antimicotico griseofulvina farmaco inibisce la mitosi fortemente in cellule fungine e debolmente in cellule di mammifero interessando funzione mitotico mandrino microtubuli (MT). Griseofulvin anche la progressione del ciclo cellulare blocchi a G 2 / M e induce apoptosi nelle linee cellulari tumorali umane. Nonostante ampio studio, il meccanismo con cui il farmaco inibisce la mitosi nelle cellule umane rimane poco chiaro. Qui, abbiamo analizzato la capacità di griseofulvina di inibire la proliferazione cellulare e la mitosi e incidere MT polimerizzazione e l'organizzazione in cellule HeLa insieme con la sua capacità di influenzare MT polimerizzazione e instabilità dinamica in vitro. Griseofulvin inibito la progressione del ciclo cellulare a prometafase / anafase della mitosi in parallelo con la sua capacità di inibire la proliferazione delle cellule. Al suo mitotico IC50 di 20 m, fusi in cellule bloccate visualizzate quasi normali quantità di MTS e MT un'organizzazione simile a mandrini bloccati dai più potenti farmaci MT-mirato. Simile ai dati pubblicati in precedenza, abbiamo scoperto che concentrazioni molto elevate di griseofulvina (100 M) sono stati necessari per inibire MT polimerizzazione in vitro. Tuttavia, concentrazioni di farmaco molto più basse (120 m) soppresse fortemente il comportamento instabilità dinamica delle MTS. Si suggerisce che il meccanismo principale con cui griseofulvina inibisce la mitosi nelle cellule umane è sopprimendo dinamiche MT mandrino in modo qualitativamente simile a quello dei farmaci antimitotici molto più potenti, compresi gli alcaloidi della vinca e taxani. In vista di griseofulvins mancanza di tossicità significativa negli esseri umani, abbiamo ulteriormente suggeriscono che potrebbe essere utile come adiuvante in combinazione con farmaci più potenti per il trattamento del cancro. Griseofulvina, un tossico antimicotico farmaco antimicotico oralmente attivo derivato da parecchie specie di Penicillium (1), è stato utilizzato per molti anni per il trattamento di Tinea capitis (tigna) e altre infezioni dermatofiti (2). Il suo meccanismo di azione è stato pensato per coinvolgere l'inibizione selettiva della mitosi cellulare fungina in associazione con il suo accumulo negli strati di cheratina dell'epidermide (1). I primi studi hanno dimostrato che griseofulvina inibisce la mitosi nei funghi sensibili in un modo simile alle azioni di colchicina e altri farmaci antimitotici che agiscono in cellule di mammifero interrompendo mandrino microtubuli (MT) la funzione (3), anche se la sua precisa meccanismo d'azione nei funghi sensibili rimane poco chiaro . Gli effetti antiproliferativi e antimitotici di griseofulvina in cellule di mammifero sono molto deboli, con l'inibizione che richiedono alte concentrazioni micromolari (4. 5). La questione se l'inibizione della mitosi da griseofulvina coinvolge MT depolimerizzazione o qualche altra azione su MTS nelle cellule umane è rimasta irrisolta. In particolare, griseofulvina inibisce chiaramente MT polimerizzazione coincidente con l'inibizione della mitosi nelle uova echinodermi (6), e l'inibizione della mitosi a concentrazioni elevate griseofulvina in cellule 3T3 avviene unitamente depolimerizzazione dei MTS mandrino (5). Al contrario, l'inibizione della mitosi da griseofulvina in cellule HeLa si è verificato in assenza di significative depolimerizzazione mandrino MT (4), che è stato interpretato come indicazione che l'inibizione mitotico è stato causato dalla perdita di valore dell'organizzazione o della funzione delle MTS mandrino piuttosto che la loro depolimerizzazione . Griseofulvin è in grado di legarsi debolmente alla tubulina mammiferi cervello e per inibire la polimerizzazione di MTS in vitro Tuttavia, l'inibizione della tubulina cervello polimerizzazione richiede concentrazioni molto elevate di griseofulvina (5. 7). MT mostra due forme di dinamiche non in equilibrio, battistrada fresatura e instabilità dinamica (3). La maggior parte del lavoro precedente sul griseofulvina è stata effettuata prima della realizzazione che MT fuso mitotico sono altamente dinamici, e che i rapidi dinamiche del Mts, non solo la loro presenza, sono fondamentali per il corretto funzionamento del mandrino (3 8 13). Inoltre, la maggior parte dei farmaci antimitotici MT-mirati che agiscono su cellule animali sopprimono dinamiche MT a concentrazioni che spesso sono di gran lunga al di sotto delle concentrazioni necessarie per inibire (ad esempio, gli alcaloidi della vinca) (9) o aumentare (ad esempio paclitaxel) (10. 11) MT di polimerizzazione . Inoltre, diversi farmaci antimitotici che inibiscono debolmente MT polimerizzazione in cellule e in vitro. compresi noscapine (12), estramustine (13), e benomyl (14), sopprimere instabilità dinamica MT e treadmilling notevolmente fortemente in assenza di rilevanti inibizione della polimerizzazione. Nel perseguire i risultati precedenti di Grisham et al. (4), abbiamo concluso che, come i farmaci di cui sopra, griseofulvina potrebbe inibire la proliferazione e la mitosi nelle cellule tumorali umane principalmente sopprimendo dinamiche MT. Così, abbiamo analizzato la capacità di griseofulvina di inibire la polimerizzazione della tubulina cervello in MTS e la sua capacità di modulare MT instabilità dinamica in vitro insieme alla sua capacità di inibire la proliferazione cellulare e la mitosi e incidere organizzazione MT in cellule HeLa. Abbiamo trovato che griseofulvina inibito mitosi in parallelo con la sua capacità di inibire la proliferazione cellulare, e che nella sua IC50 per l'inibizione della mitosi (20 M), l'organizzazione dei MTS mandrini bloccati sembrava quasi normale. Inoltre, griseofulvina legato debolmente alla tubulina, e l'inibizione della MT polimerizzazione in concentrazioni griseofulvina vitro richiesto 1 M). I nostri dati sostengono fortemente l'ipotesi che l'inibizione della mitosi nelle cellule tumorali umane è dovuto alla soppressione delle dinamiche MT mandrino. Un recente rapporto indica che griseofulvina da solo o in combinazione con nocodazole inibisce la produzione del tumore nei topi atimici (15). Prendendo queste osservazioni insieme ai dati descritti in questo lavoro, suggeriamo che griseofulvina potrebbe essere utile in combinazione con più potenti farmaci MT-mirati o con sostanze che agiscono sul nuovi obiettivi per il trattamento del cancro. MATERIALI E METODI Reagenti. Griseofulvina, GTP, EGTA, la colchicina, piperazina-1,4-bis (acido 2-etansolfonico) (tubi), e Mes sono stati acquistati da Sigma. Fosfocellulosa (P11) è stato ottenuto da Whatman. Tutti gli altri prodotti chimici utilizzati erano di grado analitico. Purificazione di capra e di bovino cervello tubulina. Capra cervello proteine ​​MT, tubulina più proteine ​​MT-associati (mappe), è stato isolato come descritto in ref. 14 e 16. proteine ​​bovino MT stato ottenuto come descritto in rif. 17. Capra e tubulina bovina sono stati separati dalle mappe utilizzando cromatografia fosfocellulosa e conservati a 80 ° C. La concentrazione tubulina è stata determinata con il metodo di Bradford utilizzando BSA come standard (18). Gli effetti di griseofulvina in indotta da glutammato MT polimerizzazione in vitro. Goat cervello tubulina (11 M) è stato polimerizzato per 30 min a 37 ° C in 25 mM tampone Pipes, pH 6,8, contenente 1 M glutammato di sodio, 1 mM GTP, e 5 mM MgCl 2 in assenza o presenza di griseofulvina. MTS polimerizzati sono sedimentate mediante centrifugazione (52.000 g per 40 min), e la massa di polimero MT è stata determinata. I campioni per la microscopia elettronica a trasmissione state preparate come descritto in rif. 14. MT e strutture sono stati osservati con un Tecnai G 2 12 microscopio elettronico (FEI, Paesi Bassi) a 43.000 ingrandimenti. Effetti della Griseofulvin su seminato Assemblea MT. MT semi nucleanti sono stati costruiti polimerizzando tubulina capra cervello (3,5 mg / ml) in presenza di 6 M glicerolo e 1 mM GTP a 37 ° C per 45 min e tranciare i MT in piccoli frammenti dal ripetuto passaggio attraverso un ago calibro 25. Per la misurazione del livello di polimero, concentrazioni griseofulvina desiderati sono stati incubati con 10 M tubulina a 37 ° C per 10 min. I semi MT sono stati poi aggiunti (rapporto 1: 5 di tubulina nella sospensione di semi di concentrazione tubulina solubile tubulina finale di 12 M). La polimerizzazione è stata iniziata aggiungendo 1 mM GTP e incubando a 37 ° C per 45 min. La massa MT è stata determinata dopo sedimenta le MT a 50.000 g (32C) per 45 min. Griseofulvina Associazione a tubulina. Capra tubulina cervello (1 M) è stato incubato con griseofulvina (0100 M) per 30 minuti a 37 ° C a 25 mm Tubi tampone, pH 6,8. L'intensità di fluorescenza a 335 nm è stata misurata utilizzando una cuvetta 0,3-cm-cammino ottico e 295 nm come lunghezza d'onda di eccitazione. intensità di fluorescenza sono stati corretti per l'effetto filtro interno, come descritto nella arbitri. 13 e 19 e sono stati utilizzati per determinare la costante di dissociazione (Kd) per griseofulvina legame tubulina (13. 19). Effetti della Griseofulvin sull'aggregazione di tubulina. Tubulina (5 M) è stato mescolato con diverse concentrazioni (5100 M) di griseofulvina in 25 Tubi mM di tampone, pH 6,8, e l'aggregazione ligando-indotta di dimeri di tubulina è stata monitorata da 90 dispersione della luce a 400 nm utilizzando uno spettrofluorometro (FP 6500, Jasco, Tokyo). Abbiamo anche usato un analizzatore di Zeta più (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) per analizzare le dimensioni degli aggregati tubulina. Colture Cellulari, proliferazione cellulare, immunofluorescenza Microscopia e mitotiche indice saggi. cellule HeLa sono state coltivate a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5 CO 2 e 95 dell'aria come descritto in rif. 14. griseofulvina è stato disciolto in 100 DMSO concentrazione DMSO finale in tutti gli esperimenti è stata di 0,1. Gli effetti della griseofulvina sulla proliferazione cellulare sono stati determinati in 24 pozzetti piastre di coltura tissutale contando le cellule con un emocitometro (Bright-Linea, Hauser scientifico, Horsham, PA). Le cellule sono state seminate a 5 10 4 cellule per ml, e dopo 24 ore, il mezzo è stato sostituito con terreno fresco contenente entrambi veicolo DMSO (controllo) o griseofulvina (0120 M), e l'incubazione è stata continuata per ulteriori 40 h. Sia il attaccati e cellule non attaccati sono state raccolte e combinate dopo tripsinizzazione (0,025 tripsina, 10 min) e contati per determinare la percentuale di inibizione della proliferazione. La microscopia ad immunofluorescenza è stata eseguita come descritto in rif. 14. Le cellule sono state seminate su poli (l-lisina) Rivestiti coprioggetti ad una densità di 1 10 5 cellule per ml contenuti in piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale. Dopo 40 h di trattamento farmacologico, le cellule sono state fissate in formaldeide 3,7 per 30 min a 37 ° C e poi trattati con fredda 100 metanolo (20C) per 20 min. Dopo i siti aspecifici erano bloccate con 2 BSA / PBS, le cellule sono state incubate con anticorpo monoclonale anti - tubulina (Sigma) a 1: 300 diluizione per 2 ore a 37 ° C. Coprioggetto furono lavate con BSA / PBS ed incubate con anticorpo anti-IgG di topo marcato con Alexa Fluor 568 (Molecular Probes) in diluizione 1: 100 per 1 ora a 37 ° C. Coprioggetto furono lavate con PBS e incubate con DAPI (1 g / ml) per 20 s. La MTS e del DNA sono stati osservati con un Eclipse TE-2000 U microscopio (Nikon). Le immagini sono state analizzate utilizzando il software ImagePro più (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). indici mitotiche sono state determinate WrightGiemsa colorazione (14). Brevemente, le cellule sono state piastrate ad una densità di 5 10 4 cellule per ml in piastre da 24 pozzetti 24 h prima dell'aggiunta di griseofulvina. Le cellule sono state poi trattate con differenti concentrazioni di griseofulvina e incubate per altri 20 o 40 h. Sia il attaccati e cellule non attaccati sono state raccolte e combinate dopo tripsinizzazione (0,025 tripsina, 10 min), lavate con PBS, e quindi trattate con 0,5 PBS per 10 min in ghiaccio. Le cellule sono state fissate con soluzione di metanolo / acido acetico (3: 1, vol / vol). Infine, le sospensioni cellulari sono state distribuite su vetrini fredda, essiccato all'aria, e colorate con una soluzione al 10 Giemsa. Analisi di MT instabilità dinamica. tubulina purificata (12 M) è stato polimerizzato per 30 minuti alle estremità di riccio (Strongylocentrotus purpuratus) semi axonemal a 37 ° C in presenza o in assenza di concentrazioni desiderate di griseofulvina in 87 mM Tubi / 36 mM MES / 1,4 mM MgCl 2 / 1 mM EGTA, pH 6,8. È stato registrato il instabilità dinamica alle più-estremità dei singoli MT (8). Le estremità sono state designate come sia più o meno sulla base del tasso di crescita, il numero di MT che cresceva alle estremità opposte dei semi, e le relative lunghezze dei MT. MT variazioni di lunghezza con il tempo sono stati analizzati 30 minuti dopo l'inizio della polimerizzazione, quando i MT hanno raggiunto lo stato stazionario (8). I punti dati sono stati raccolti a 3- a intervalli di 5 s. A MT è stato considerato in una fase di crescita se aumentato in lunghezza di 0,3 m / min. MT lunghezza delle variazioni di 0,2 m per tutta la durata di sei punti di dati sono stati considerati di essere in uno stato attenuato. Venti a 30 metri sono stati analizzati per ogni condizione sperimentale. Risultati L'inibizione della proliferazione delle cellule HeLa e la mitosi da Griseofulvin. Per prima determinato il rapporto tra la capacità di griseofulvina di inibire la mitosi nelle cellule HeLa e la sua capacità di inibire la proliferazione cellulare. Griseofulvin inibito la proliferazione delle cellule debolmente e in modo concentrazione-dipendente, con l'inibizione metà-massimale si verificano a 25 4 M (Fig. 1). Gli effetti della griseofulvina sulla mitosi strettamente parallelo sua capacità di inibire la proliferazione, come mostrato in Fig. 1. A 20 h di trattamento farmacologico, 49 delle cellule sono stati bloccati alla mitosi a 20 M griseofulvina, e 58 sono stati bloccati al 30 M griseofulvina (Fig. 1). A 40 h di trattamento farmacologico, 35 e 43 delle cellule sono stati arrestati in mitosi da 20 e 40 M griseofulvina, rispettivamente (dati non mostrati). Pertanto, il blocco della mitosi nelle cellule HeLa da griseofulvina correla bene con la sua capacità di inibire la proliferazione delle cellule. L'inibizione della proliferazione () e la progressione mitotica () in cellule HeLa da griseofulvina. cellule HeLa sono state trattate con varie concentrazioni di griseofulvina (0120 M) per 40 h, e la percentuale di inibizione della proliferazione è stata determinata contando le cellule. L'indice mitotico è stata determinata utilizzando il metodo di colorazione WrightGiemsa dopo incubazione delle cellule con varie concentrazioni di griseofulvina (0120 M) per 20 h. In assenza di griseofulvina, 2.8 0.5 delle cellule DMSO-trattati sono risultati nella mitosi. L'organizzazione dei cromosomi MTS e nei mandrini cellulari bloccati stato analizzato mediante immunofluorescenza usando anticorpi contro tubulina e colorazione DAPI dei cromosomi. In cellule di controllo, i mandrini metafase bipolari e la stretta distribuzione dei cromosomi erano simili a quelli descritti in refs. 20 e 21 (Fig. 2). A 20 M griseofulvina (40 h di trattamento), che ha bloccato la proliferazione e la mitosi da 45 e 35 rispettivamente, la maggior parte dei mandrini erano bipolare e apparve quasi normale, con qualche non cromosomi allineate correttamente sulla piastra metafase (Fig. 2 ). A 40 M griseofulvina, la maggior parte dei mandrini erano bipolare, ma le MT sono stati sostanzialmente perturbato (Fig. 2). A 120 M griseofulvina, una concentrazione che inibisce la proliferazione di quasi il 100, non MTs mandrino erano presenti nelle cellule bloccate ei cromosomi sono stati organizzati in cluster sferici anonimi (Fig. 2). Effetti della griseofulvina su MTS mandrino e l'organizzazione dei cromosomi. cellule HeLa sono state incubate con le concentrazioni indicate di griseofulvina per 40 h. MT mandrino (rosso) e cromosomi (blu) sono stati analizzati come descritto in Materiali e Metodi. Gli effetti di griseofulvina sull'organizzazione di MTS in cellule in interfase ad una data concentrazione griseofulvina sono stati meno pronunciati rispetto ai suoi effetti sulle MT mandrino. A 40 ore di incubazione con 20 e 40 M griseofulvina, che inibisce la proliferazione del 45 e 70 rispettivamente, le MT interfase erano quasi intatti. Tuttavia, a 40 M griseofulvina, 8590 delle cellule interfase erano multinucleare e significativamente maggiore di cellule di controllo (Fig. 3). A 120 M griseofulvina, che la proliferazione completamente inibita, 50 delle cellule rimaste in interfase e aveva un numero considerevole di MTS, anche se la densità della MT è stata ridotta, rispetto alla densità di cellule di controllo. È interessante notare che la maggior parte delle cellule mononucleate interfase erano, suggerendo che non erano in grado di progredire nel ciclo cellulare. Effetti di 20, 40, e 120 M griseofulvina su interfase MT in cellule HeLa. cellule HeLa sono state incubate con le concentrazioni indicate di griseofulvina per 40 h. Effetti della Griseofulvin sulla polimerizzazione della tubulina in MTS in vitro e il legame di Griseofulvin alla tubulina. Gli effetti della griseofulvina sulla polimerizzazione della tubulina capra purificati cervello in MTS in vitro sono stati analizzati con saggi sedimentazione massa polimerica. Come mostrato in Fig. 4 A. una concentrazione griseofulvina alto come 100 M non aveva effetto sulla polimerizzazione indotta da glutammato. Identici risultati sono stati ottenuti quando la polimerizzazione è stata condotta con la tubulina purificata in assenza di glutammato utilizzando semi glicerolo nucleazione polimerizzazione (dati non mostrati). Abbiamo analizzato la struttura delle MTS microscopia elettronica a trasmissione quando i MT sono stati polimerizzati cominciando con puro tubulina in presenza di 0,8 M glutammato e con una preparazione proteica MT ricco-MAP in assenza di glutammato. Non abbiamo rilevato alcuna alterazione della struttura a 5, 20, o 50 M griseofulvina in tutte le condizioni di polimerizzazione (dati non riportati). Allo stesso modo, 100 M griseofulvina non è cambiata la struttura MT in presenza di mappe. Questi dati sono in linea con il lavoro precedente che mostra che il 60 M griseofulvina non cambia MT struttura (4). Tuttavia, abbiamo trovato che 100 M griseofulvina struttura MT alterata in presenza di 0,8 M glutammato (dati non mostrati). Effetti della griseofulvina sulla tubulina polimerizzazione e il suo legame con la tubulina. (A) Effetti della griseofulvina sulla massa polimerica MT. Tubulina (11 M) in tubi tampone, pH 6,8, contenente 1 mM GTP e 1 glutammato M di sodio è stato polimerizzato in MTS in assenza o in presenza di differenti concentrazioni di griseofulvina per 30 min a 37 ° C. Polimeri stati sedimentati, e la massa di polimero è stato determinato come descritto in Materiali e Metodi. (B) Il legame di griseofulvina alla tubulina. Associazione a tubulina è stato determinato attraverso il monitoraggio delle tubuline intrinseca di fluorescenza del triptofano. Tubulina (1 M) è stato incubato in 25 Tubi mM di tampone con varie concentrazioni di griseofulvina da 0 (), 10 (), 30 (), 50 (), e 100 () M, e di emissione spettri sono stati registrati dopo 30 min di incubazione a 37 ° C. L'intensità di fluorescenza a 335 nm è stato utilizzato per calcolare il K d per griseofulvina. (C) trama doppio reciproco per il legame di griseofulvina alla tubulina. , Frazione di siti occupati da griseofulvina Lf, concentrazione griseofulvina gratuito vincolante. Per determinare la costante di affinità per il legame di griseofulvina alla tubulina, abbiamo sfruttato il fatto che il legame di griseofulvina alla tubulina riduce tubuline intrinseca fluorescenza del triptofano (22). Analisi della riduzione tubulina di fluorescenza in funzione della concentrazione griseofulvina ha prodotto una costante di dissociazione molto debole di 300 12 M (Fig. 4 B e C). Questo relativamente debole costante di legame è nello stesso intervallo, ma è 2,4 volte più debole di quello riportato da Chaudhuri e Luduena (22). Una differenza di questa portata potrebbe essere semplicemente a causa delle condizioni di buffer, sottili differenze nello stato post-traslazionale della tubulina purificato, o varie condizioni sperimentali utilizzati in due studi. Abbiamo anche esaminato l'effetto di griseofulvina sulla struttura secondaria di tubulina di gran lunga-UV spettroscopia di dicroismo circolare e abbiamo trovato che una concentrazione fino a 100 M non ha alterato tubuline struttura secondaria (dati non mostrati). Inoltre, nessuna aggregazione dei dimeri di tubulina è stato rilevato in assenza e in presenza di concentrazioni diverse griseofulvina (5100 m) da 90 light scattering (dati non mostrati). Tuttavia, in condizioni simili, vinblastina (30 M) è stato trovato per indurre l'aggregazione di dimeri di tubulina fortemente (dati non mostrati). L'esperimento di luce-dispersione dinamica ha anche mostrato che fino al 50 M griseofulvina non induce l'aggregazione rilevabile di dimeri di tubulina. Tuttavia, 100 M griseofulvina indotto aggregazione tubulina debolmente (dati non mostrati). Soppressione di MT Instabilità Dinamica a stato stazionario in vitro da Griseofulvin. Un certo numero di farmaci antimitotici MT-mirati, tra vinblastina (9) e paclitaxel (10), sopprimere MT instabilità dinamica a concentrazioni molto più basse di quelle richieste per modificare la massa polimerica MT (3). Così, abbiamo voluto determinare se griseofulvina possedesse capacità simile. Griseofulvin ha effettivamente sopprimere instabilità dinamica a concentrazioni molto inferiori a quelli richiesti per inibire la polimerizzazione. tracce vita-storia dei singoli stazionarie MT cervello bovino in assenza o in presenza di 20 M griseofulvina sono mostrati in Fig. 5. Controllo MT visualizzata tipici di crescita e accorciando la dinamica (Fig. 5 A), mentre la dinamica di MTS trattati con 20 M griseofulvina sono stati fortemente ridotti (Fig. 5 B). Le azioni di griseofulvina sui singoli parametri instabilità dinamica sono stati determinati quantitativamente (Tabella 1). In particolare, griseofulvina soppresso relativamente fortemente il tasso di crescita e di accorciamento. Ad esempio, 5 M griseofulvina ha ridotto il tasso di crescita del 50 e del tasso di accorciamento da 70. Inoltre, 5 M griseofulvina anche ridotto la lunghezza media ridotta per ogni evento accorciamento del 40, ma non ha ridotto la lunghezza media della crescita. Alla zona di stato stazionario, sia in vitro che in vivo. MT spendono una frazione di tempo in uno stato attenuato o in pausa, né crescita né accorciamento rilevabile. Come mostrato nella tabella 1. griseofulvina ha ridotto fortemente la frazione di tempo Master Trainer speso in crescita e un accorciamento e una maggiore la percentuale di tempo che i MTS trascorso nello stato attenuato. Specificamente, alla massima concentrazione griseofulvina esaminato (20 M), griseofulvina aumentato la frazione di tempo le MTS trascorso nello stato attenuato da 8 volte, dal 6 del tempo a 47 del tempo. variazioni della lunghezza dei singoli MT a loro più termina a stato stazionario in assenza (A) o presenza (B) di 20 M griseofulvina (vedi Materiali e Metodi). Tabella 1. Effetto della griseofulvina sulle dinamiche dei singoli microtubuli Le frequenze di transizione tra le crescenti, accorciamento, e fasi attenuati, che può riflettere il guadagno e la perdita della stabilizzazione tubulinGTP o tubulinGDPP I CAP in MT estremità, sono considerati importanti la regolazione della dinamica MT nelle cellule. Griseofulvin fortemente soppressa sia per il salvataggio e frequenze catastrofali (Tabella 1). Ad esempio, 5 M griseofulvina ridotto la frequenza catastrofe 60 e la frequenza di salvataggio per 30. Tali dati, insieme con i risultati indicano che griseofulvina inibisce il tasso di accorciamento, indicano che griseofulvina agisce direttamente al MT plus estremità. Dinamicità è una misura della crescita percepibile complessiva e accorciamento ad una estremità MT per unità di tempo. Come mostrato nella Tabella 1. griseofulvina soppressa fortemente dinamicità in modo concentrazione-dipendente, con 20 M griseofulvina sopprimere questo parametro 10 volte. Discussione Soppressione di MT instabilità dinamica e l'inibizione della mitosi in cellule HeLa per Griseofulvin. Abbiamo trovato che griseofulvina, un antimicotico orale mirata alla tubulina e / o MT, inibisce la mitosi in cellule HeLa al passaggio metafase / anaphase in parallelo con la sua capacità di inibire la proliferazione cellulare. I risultati sostengono fortemente l'idea che l'inibizione della proliferazione di queste cellule di griseofulvina è dovuto alla inibizione della mitosi. Simile ai risultati di studi precedenti (4. 5. 7), l'inibizione è stata debole, con l'inibizione mezza massima di proliferazione e mitosi che si verificano ad una concentrazione di griseofulvina 2530 M. L'esame dei fusi mitotici e l'organizzazione interphase MT nelle cellule bloccate a IC 50 ha rivelato che i mandrini sono bipolare con quasi normale organizzazione MT, con diversi cromosomi situati su o vicino ai poli. Tuttavia, la matrice interfase MT nelle cellule a griseofulvins IC 50 non era rilevabile alterato. Tale blocco prometafase / metafase con pochi cambiamenti nell'organizzazione MT mandrino e in assenza di variazioni rilevabili nell'organizzazione MT in cellule in interfase è simile a quello indotto da concentrazioni relativamente basse di farmaci antimitotici molto più potenti, incluso vinblastina, paclitaxel e cryptophycin 52 (3). Sebbene la potenza dei farmaci più potenti è molto superiore a quella della griseofulvina, questi farmaci, come griseofulvina, inibire o stimolare MT polimerizzazione a concentrazioni elevate di droga, ma il loro concentrazioni efficaci più basse, sopprimono MT instabilità dinamica senza influenzare la massa polimerica (9 . 11). In linea con i risultati descritti in rif. 22. abbiamo scoperto che griseofulvina legato debolmente a tubulina solubile (K d. 300 M). Ma sorprendentemente, quando la capacità di griseofulvina di inibire la polimerizzazione di purificato tubulina libera-MAP in MTS è stato analizzato a concentrazioni fino a 100 M, quando 30 della tubulina sarebbero stati droga-bound, griseofulvina non ha influenzato massa polimerica, indicando che il legame di griseofulvina alla tubulina non inattiva la tubulina sequestrando esso. Griseofulvin soppressa stato stazionario comportamento instabilità dinamica dei MT sorprendentemente fortemente relativi alla sua capacità di inibire la polimerizzazione. Specificamente, a 20 M griseofulvina, la IC50 per l'inibizione della proliferazione e della mitosi in cellule HeLa, il tasso MT-accorciamento è stato ridotto di 75 volte per cento che le MT rimasti in uno stato attenuato, né crescita né accorciamento rilevabile, è stato aumentato 8 a 9 volte e la dinamicità complessiva è stata ridotta di quasi il 90. Questi dati sostengono fortemente l'idea che l'inibizione della proliferazione e mitosi in cellule HeLa da griseofulvina è determinato dalla soppressione delle dinamiche di fuso mitotico MT. Il meccanismo di azione di griseofulvina. Anche se griseofulvina ha dimostrato di inibire la mitosi in metafase, agendo sia su MT polimerizzazione o organizzazione MT in un gran numero di tipi cellulari, comprese le cellule fungine, embrioni echinodermi, e il mouse e cellule in coltura umane, il suo meccanismo d'azione è rimasta poco chiara. Ad esempio, Grisham et al. (4) hanno trovato che quando mitosi stato inibito in cellule HeLa 20 M griseofulvina, le MT mandrino erano presenti, apparivano normali nella struttura, e sono normalmente fissati ai poli del fuso e cinetocori, come rivelato dalla microscopia elettronica. Osservazioni simili sono state fatte in cellule HeLa bloccate a concentrazioni griseofulvina moderate (1020 m), mentre alte concentrazioni di griseofulvina (50 m) ha fatto distruggere i MT (5). Questi risultati possono essere compresi alla luce dei risultati descritti qui, indica che in vitro griseofulvina sopprime MT instabilità dinamica a concentrazioni che non influenzano la massa polimerica MT. Si suggerisce che la soppressione delle dinamiche MT mandrino può essere il meccanismo principale attraverso il quale griseofulvina inibisce la mitosi in cellule HeLa e forse in altre cellule umane. Tale meccanismo è coerente con l'azione dei farmaci antimitotici più potenti, tra cui vinblastina e paclitaxel, che sopprimono anche la dinamica MT a concentrazioni che sono ben inferiori a quelli necessari per influenzare MT massa di polimero (9. 10). Il comportamento instabilità dinamica dell MTS non può essere analizzata in cellule HeLa, perché le cellule non sono sufficientemente piana tale analisi. Tuttavia, sarà utile effettuare una tale analisi in una linea favorevole cellule tumorali umane, come le cellule MCF7. Gli effetti riportati di griseofulvina sulla polimerizzazione di MTS mammiferi cervello in vitro sono un po 'più difficile da razionalizzare. Alcune delle differenze può essere dovuto in parte al fatto che l'inibizione di MT polimerizzazione griseofulvina richiede concentrazioni griseofulvina molto più elevate quando la polimerizzazione viene effettuata in assenza, piuttosto che in presenza di MAP (7). Nel presente studio, griseofulvina non ha influenzato la polimerizzazione del libero-MAP tubulina in MTS ad una concentrazione fino a 100 M (Fig. 5), e in linea con questi risultati, Sloboda et al. (23) hanno trovato che l'inibizione della polimerizzazione richiesto concentrazioni estremamente elevate griseofulvina (ad esempio 500800 M). Pertanto, una concentrazione sufficientemente elevata griseofulvina può inibire la polimerizzazione della tubulina cervello in MT in vitro. Al contrario, molti gruppi hanno trovato che griseofulvina inibisce la polimerizzazione della tubulina più MAP in MTS in vitro nello stesso intervallo di concentrazione come usato qui. In particolare, Roobol et al. (24) hanno trovato che le concentrazioni griseofulvina tra 20 e 200 M inibiti polimerizzazione quando le mappe erano presenti. Roobol et al. (24) e Weber et al. (7) ha riferito che griseofulvina potrebbe indurre l'aggregazione di proteine ​​MT (tubulina oltre a mappe) a temperature fredde. Relativo a questi risultati, Roobol et al. (25) hanno trovato che griseofulvina può legare in modo efficiente alle mappe pecore-encefalica in vitro a concentrazioni griseofulvina che inibiscono MT polimerizzazione. Tali dati suggeriscono che la capacità di griseofulvina di inibire MT polimerizzazione quando le mappe sono presenti possono essere correlati a una capacità di griseofulvina di influenzare le interazioni MAPtubulin. Come potrebbe Griseofulvin reprimere MT instabilità dinamica Griseofulvin soppresso fortemente l'instabilità dinamica allo stato stazionario di MTS bovina cervello senza mappa in vitro a concentrazioni ben inferiori a quelli necessari per ridurre la massa di polimero. soppressione significativa del tasso di accorciamento e la frequenza catastrofe alle estremità più verificato a concentrazioni griseofulvina appena 0,5 M, quando, sulla base della affinità di griseofulvina per tubulina, molto poco tubulina solubile avrebbe potuto essere vincolato al farmaco (1 mole di griseofulvina legato per 100 moli di tubulina). Questi dati indicano che griseofulvina deve sopprimere dinamiche MT a sua concentrazione minima efficace da un meccanismo end-avvelenamento. L'unico modo che il farmaco potrebbe inibire plus-end accorciamento allo stato stazionario è agendo direttamente alla fine più. È interessante notare che la griseofulvina non inibisce la polimerizzazione di MTS a stato stazionario, ancora una volta lo stato stazionario è raggiunto, inibisce fortemente la velocità e il grado di MT accorciamento. Forse un po 'come l'azione del complesso colchicinetubulin a MT estremità (26. 27), complessi griseofulvintubulin diventare costituita a MT estremità, formando così un copolimero. Tale meccanismo può anche verificarsi con benomyl (14). L'incorporazione dei complessi griseofulvintubulin, pur non essendo in grado di inibire Inoltre tubulina, riduce fortemente la perdita tubulina aumentando la forza delle interazioni tra subunità di tubulina nel reticolo. Forse aumenta griseofulvina la stabilità alla fine MT modificando le dimensioni o chimica natura del tappo di stabilizzazione (28). L'eventuale uso di Griseofulvin per il trattamento del cancro. In considerazione della sua capacità di stabilizzare le dinamiche MT e di inibire la mitosi nelle cellule umane, è piuttosto notevole che griseofulvina è così ben tollerato quando somministrato all'uomo per il trattamento di infezioni fungine. Il farmaco può causare tossicità in animali che sarebbero prevedibili in base al suo meccanismo di azione (29. 30), ma tali reazioni avverse non sembrano verificarsi in modo sensibile nell'uomo (2).